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ELISA實驗常見三大問題原因解析(2019年全)


發布日期:[2019-08-28] 共閱[211]次

    ELISA實驗常見的幾大結果問題有標準曲線較差、無信號、變異系數(CV)較大等,那么實質導致的原因呢有多方面,具體的情況如下:

?標準曲線較差

原因一:標準品溶液配置有誤
解決方案:確認是否進行正確稀釋。

原因二:標準品復溶不當
解決方案:開蓋前進行離心;檢查復溶后是否存在不溶物。

原因三:標準品已降解
解決方案:按推薦方式保存和處理標準品。

原因四:曲線的標度不適合
解決方案:嘗試使用不同標度繪制曲線,例如雙對數、5 參數擬合。

原因五:移液器加樣誤差
解決方案:正確使用經過校準的移液器

無信號

原因一:孵育時間過短
解決方案:樣品在 4 ℃ 孵育過夜,或遵循試劑的實驗方案。

原因二:靶標含量低于檢測范圍
解決方案:減小樣品的稀釋倍數或濃縮樣品。

原因三:樣品類型不適用
解決方案:對于沒有驗證過的樣品類型,檢測信號可能減弱或沒有使用驗證過的樣品類型作為陽性對照同時進行檢測。

原因四:抗原表位被孔板吸附,無法識別
解決方案:使用直接或間接 ELISA 方法增強檢測肽的能力,將肽偶聯到大的載體蛋白上,然后包被到微量滴定板。

原因五:檢測緩沖液的相容性
解決方案:確保檢測緩沖液與靶標兼容(例如,保留酶活性、保留蛋白質相互作用)。

原因六:檢測試劑不足
解決方案:遵循試劑的實驗方案,增加檢測試劑的濃度或用量。

原因七:樣品制備不正確
解決方案:確保進行正確的樣品制備/稀釋。樣品可能與微量滴定板測定形式不兼容。

原因七:抗體不足
解決方案:嘗試不同的抗體濃度/稀釋。

原因八:孵育溫度過低
解決方案:確保在正確溫度下進行孵育。所有試劑(包括孔板)在進行實驗前應處于室溫,或試劑的實驗方案所建議的溫度。

原因九:波長不正確
解決方案:確認波長,再次讀板。

原因十:孔板被強力洗滌
解決方案:檢查并確保自動洗滌系統的壓力正確。如果手動洗滌,則輕輕吸取沖洗緩沖液。

原因十一:孔變干
解決方案:測定開始后,不要讓孔變干。將所有的孵育步驟使用封口膜或膠帶密封孔板。

原因十二:酶反應的顯色速度慢
使用前配制底物溶液。確保母液未過期、未污染。延長孵育時間。

變異系數(CV)較大 

原因一:孔中有氣泡
解決方案讀板前,確保不存在氣泡。

原因二:孔洗滌不均/未充分洗滌
解決方案:檢查洗板機的所有管口是否暢通。使用推薦方法進行洗滌。

原因三:試劑混勻不充分
解決方案:確保所有試劑充分混勻。

原因四:移液量不一致
解決方案:正確使用經過校準的移液器。

原因五:邊緣效應
解決方案:確保孔板和所有試劑處于室溫。

原因六:樣品制備或保存條件不一致
解決方案:確保樣品制備保持一致,使用zui優的樣品保存條件(例如盡可能減少反復凍融)。

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